【摘要】 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4 (PAK4)是生物学界最新发现的一类蛋白因子，它在细胞信号转导过程中起很重要的作用，因而，PAK4在肿瘤的发生，发展过程中是一个特殊的预警分子。本文针对PAK4的主要生物学特性做一描述，以探索其在癌症早期诊断，早期治疗，抗癌抑癌等方面的作用。 【关键词】 PAK4 细胞信号转导 肿瘤治疗 1 PAKs家族概述 Pak(p21-activated protein kinases，Paks)丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶是Rho家族中GTP酶的重要效应物，它在细胞形态学和动力学以及细胞转化的调控方面起到了很重要的作用。当前，约有28种人类STE20激酶被分为10个亚族，这种划分是基于它们的调节区和催化区在系统发生及结构上的不同而进行的。人类的六种Paks激酶也已被区分为两个亚系。第一个亚系包括Pak1(Pakα)、Pak2(Pakγ)、Pak3(Pakβ)，它们的催化区中有80%-90%的序列同源性。近来才发现的第二亚系中含有Pak4、Pak5和Pak6，它们也彼此关系密切，但和第一亚系中的Pak1、Pak2和Pak3催化区序列同源性只有40%-50%。所有的Paks成员具有一个p21结合区域（PBD），它可以与Rho家族中的GTP酶结合。GTPases和PBD相互作用可使Paks的内在激酶活性脱抑制，从而导致活性环的自身磷酸化和全酶的激活。 Pak1-3的脯氨酸富集区是与Pak相互作用交换子PIX/Cool SH3作用的主要位点。除了PIX外，Paks还可以与Nck受体结合并且可以直接恢复为生长因子受体。由此看来，虽然Pak4-6没有明显的PIX/Cool结合基序，但两个Pak亚系在它们调节与催化区域的组成和结构方面具有很好的一致性。Paks作为GTPases的效应物，通过对肌动蛋白细胞构架的调节，在细胞形态学和动力学的调控上起到了重要的作用。 Paks和Rac/Cdc42相互作用，并且参与细胞粘附与迁移过程中Rac/Cdc42介导的肌动蛋白的合成（Daniels and Bokoch，1999）。Pak家族中的所有六个单体具有高度保守的C端激酶区和N端Cdc42/Rac相互作用粘附区（CRIB）（Burbelo et al.，1995），又名GTP酶结合区（GBD）（Symons et al.，1996）。Pak1-3与Cdc42和Rac结合，导致其构象的改变，这个过程会在较低的程度上缓解自我抑制和激活激酶的活性。与之相反，Pak4和Pak6与Cdc42高效地作用，但酶的激活并不依赖这个结合过程。Pak1-3在GBD的N末端含有一种SH3结合位点，它负责和接头蛋白Nck结合。另外，在GBD与C末端激酶区域之间也有一个SH3结合位点，它可以调节和PIX的结合，PIX是Rac的一种假设交换因子。Pak4则没有这种SH3结合位点，也不能与Nck和PIX作用，但它在GBD与激酶区域间有七个假设的SH3结合位点。 Paks的两个亚群均可以促使细胞中肌动蛋白的重新形成。例如：Pak1能诱导片状伪足的形成，还可以定位在成纤维细胞的膜皱褶上；Pak4被证明在内皮细胞上由Cdc42诱导的丝状伪足扩展方面有重要的作用；而Pak5可以导致轴突的延伸。Paks还可以对细胞进行调控，激活的Pak1，Pak2和Pak4的表达可以促进细胞变圆。 为了探讨Pak4在肿瘤遗传学方面的功用，国外学者分析了其在几种瘤细胞系中的表达情况。结果表明：Pak4经常在来源于人体的多种组织器官的肿瘤细胞系中呈现过表达，且丝氨酸位点（Ser-474）很可能是Pak4酶活性区域中的自身磷酸化位点，丝氨酸到谷氨酸位点的突变体（S474E）促使其获得了酶活性。PAK4和Cdc42在高尔基体膜中同时表达，我们可利用针对Ser-474位点的磷酸化特异性抗体来探查有活性Pak4的存在。进而，Pak4突变体（S474E）可导致NIH3T3细胞的不依赖贴壁生长。另一方面，无活性的PAK4(K350A，K351A)可以通过活性Ras来有效地阻止HCT116癌细胞克隆的转化和抑制其不依赖贴壁生长。综上所述：Pak4对细胞癌化和Ras驱动的瘤细胞不依赖性贴壁生长具有极其重要的影响。 越来越多的事实表明：Pak激酶在细胞癌化，Ras促使的不依赖贴壁细胞生长和细胞存活的调控方面具有很重要的影响。例如：无活性的Pak等位基因会抑制Rat1和施瓦尔贝核细胞的Ras转化。同样地，Pak2的功能缺失性等位基因也会干扰Ras介导的细胞周期。最新的一些研究也提供了关于Pak1在人类乳腺癌上皮细胞的不依赖贴壁细胞生长和侵袭力方面的重要证据。另外，Pak1还可以调节BAD的活性。Pak4也可以保护细胞免受外因导致的细胞凋亡，促进细胞粘附以及调节啮齿动物成纤维细胞的不依赖贴壁生长。 2 PAK4的生化结构 人源PAK4位于第19号染色体上，其转录结构大小约为53.59kb。PAK4基因上共有10个外显子，均位于正链上，中间由9个内含子所间隔。最大的外显子长979kb，最小的长73kb；内含子最长的为42310kb，最小的为139kb。 3 PAK4的生物学特性 3.1 Pak4是最新发现的Pak家族中的一员 它与别的Paks序列上有很大的差别，特别是在调节区域上的区别，但Pak4有一个GBD的修饰区。Pak4是Cdc42的一个靶点，它为Cdc42促进纤羽的形成提供了一种良好的途径。野生型的Pak42不能独立地促进明显的细胞构架的改变，只有Pak4和Cdc42的共同表达可以使纤羽的正常形成。与Pak1相比，Pak4调节细胞构架形成的过程更依赖于其酶活性和PBD区域的有无。近来，人们已经构建出一种Pak4的突变体Pak4(S445N)，它只能导致暂时性的纤羽形成。人们还发现在C2C12细胞中，Pak4还会促进弹性纤维的转动和溶解。除此之外，在C2C12细胞中Pak4（S445N）的高效表达会促进多聚肌动蛋白的形成。研究表明：Pak4和Pak4(S445N)都可使LIMK1高度磷酸化。实际上，它们磷酸化LIMK1的能力要远远地高于等量的野生型或具有普通活性的Pak1。激活的Pak4也可以提高LIMK1磷酸化cofilin的能力。Pak4或Pak4(S445N)的存在对肌动蛋白簇的刺激是必要的，LIMK1的缺失会抑制Pak4(S445N)对细胞构架改变的促进作用，一个非磷酸化的cofilin突变体在Pak4(S445N)的参与下也会阻止细胞骨架和形态的改变。 3.2 Pak4可以调节蛋白酶LIM1的活性 利用蛋白质结合分析的方法，我们发现Pak4可以与LIMK1特异地结合。免疫复合物激酶分析法表明：野生型和具有活性的Pak4都可以较强地磷酸化LIMK1，这种作用的强度要远远高于Pak1，且具有活性的Pak4能刺激LIMK1对cofilin进行磷酸化。免疫荧光实验表明，Pak4与LIMK1共同作用可以刺激C2C12细胞的构架改变。功能缺陷型LIMK1和cofilin突变体会抑制特定的细胞骨架的形成，反过来细胞形态的改变会使活性Pak4突变。细胞骨架中肌动蛋白的组成对哺乳动物细胞的功能有很大的影响。细胞骨架的组成在多种细胞行为中起到重要的作用，其中包括：细胞激活，细胞粘附，细胞增生以及胞质分裂。调节细胞骨架形成信号酶的异常调控会对细胞活动起到负面影响，例如会导致癌基因的转化和细胞增生与活化的缺损。充分理解细胞骨架调节蛋白对多聚肌动蛋白的调节机制对细胞生物学方面更深入地探讨特别是在细胞信号转导上有着重要的意义。Rho家族中的GTP酶对调节哺乳动物肌动蛋白组成上有重要的作用。这个家系中的三种主要的作用因子包括Cdc42，Rac，Rho，它们分别用来调控纤羽，片状伪足和弹性纤维的形成。除了调节细胞骨架组成外，GTP酶还有一些其他的调节作用，如细胞粘附，细胞信号转导途径的激活，细胞增生，细胞癌化及癌细胞的侵袭性。 LIMK1可以在脑组织中高度地表达，也可以在其他许多组织器官中表达。LIMK1的缺损会导致神经紊乱性Williams综合征，也会使神经元之间的联系变得异常化。LIMK1会导致明显的细胞构架的改变，这主要是由肌动蛋白蔟的改变造成的。LIMK1的磷酸化使cofilin这样的细胞构架蛋白失活，从而抑制cofilin的肌动蛋白解聚合作用。具有活性的Rac也可以导致LIMK1的磷酸化，而Pak4是Rac与LIMK1之间磷酸化作用的纽带。 3.3 Pak4还可以被一种上皮细胞的迁移刺激因子HGF激活 在没被刺激的MDCK细胞上，Pak4的活性会导致弹性纤维的减少，一旦细胞受到HGF的刺激，就会导致病灶物和细胞环化物的消失。这一过程依赖Pak4的活性，但无须Cdc42的参与。活性Pak4定位在细胞的外周蛋白上，而不是特异地定位在细胞的扁平状伪足上，这种HGF因子正是用来协助野生性Pak4定位在细胞的外周蛋白上。LY294002，它是一种磷酸肌醇（三）激酶（P13K）抑制剂，能够有效地抑制HGF诱导Pak4的激活，重新定位以及细胞变圆。然而，LY294002的存在可以使Pak4的激酶区域的C末端诱导细胞变圆，这说明Pak4的N末端不是活性区域。这些事实表明，HGF对Pak4的刺激是通过P13K来完成的，且Pak4有助于HGF诱导的肌动蛋白组成和细胞基质粘附的改变。
HGF是一种多功能的细胞因子，它可以通过与酪氨酸激酶的腺苷甲硫氨酸受体的作用而成为上皮细胞的活力刺激因子。HGF刺激上皮细胞后使其失去了细胞间的正常形态，出现了一种类似于纤维母细胞的形态，并且细胞变得更容易转移。Pak1除了可被HGF激活外，还可以被其它的转移前刺激因子所激活，如PDGF。相反，Paks的第二亚群的生长刺激因子还没有被发现。 3.4 角化细胞生长因子（KGF） 是纤维母细胞生长因子（FGF）家族中的一员，它可以作为上皮细胞的一种重要的保护性因子。KGF的受体本身具有酪氨酸激酶的活性，可专门在普通上皮细胞和肺上皮组织中表达。KGF的作用是可以保护肺组织免受各种异物的入侵，但其保护机制还未完全阐明。为了很好地说明KGF保护上皮细胞的机制，科学家们采用了酵母双杂交分析的方法来寻找与KGF受体（KGFR）相互作用的蛋白。结果发现KGFR的细胞质区域和Pak4作用。Pak4是Paks家族中最具多样的一种。但目前Pak4激活的刺激因子尚未找到，研究资料表明：依靠KGFR酪氨酸激酶的活性，Pak4可与KGFR结合。Pak4的显性负性突变体在上皮细胞中能阻止KGF介导的氧化剂对caspase-3的激活作用。研究得出：Pak4是KGF抵抗上皮细胞癌化过程中的一种重要的调节因子。 3.5 Pak4与整合素αvβ5相互作用来调节αvβ5 协调的细胞迁移 Pak1通过调节肌球蛋白链激酶和LIM激酶活性来影响细胞的迁移。采用一种全新的技术来说明Pak4直接与细胞内区域相互作用的机制，分析Pak4 是如何调节癌细胞的运动性。酵母双杂交技术显示Pak4与整合素β5亚基的细胞质区域结合，同样形式的相互结合也可以在哺乳动物细胞内源Pak4和整合素αvβ5中见到。通过对Pak4与整合素β5膜端区域结合图的绘制，发现整合素可与Pak4 COOH端505-530氨基酸区段结合。更重要的是，整合素β5与玻基结合素作用，导致Pak4从细胞浆到扁平伪足结构的改变，伪足结构是Pak4和整合素αvβ5作用的部位。Pak4可以诱导αvβ5介导的而不是β1介导的人乳腺癌细胞的迁移，但没发现细胞表面整合素表达水平的改变。总之，Pak4可以与整合素αvβ5相互作用且可以选择性地提高αvβ5介导的细胞转移。 4 结语 Pak4是生物学界新近发现的一种细胞信号转导领域中的重要因子，对其结构及生物学特性方面的研究正在积极地开展。我们探讨Pak4及Paks家族其它成员的特性，对分析关于肿瘤遗传学、细胞癌变、细胞凋亡等一些重要的细胞生物学现象，具有重要的意义，也为癌症等某些疑难病症提供了新的科学依据。 【参考文献】 1 Marinella G. Callow，Felix Clairvoyant，Shirley Zhu，et.al.Requirement for PAK4 in the Anchorage-independent Growth of Human Cancer Cell Lines. The Journal of Biological Chemistry，2002，277(1)：550-558. 2 AN QU，MARTA S.CAMMARANO，QING SHI，et al.Activated PAK4 Regulates Cell Adhesion and Anchorage-Independent Growth. Molecular and cellular biology，2001，3523-3533. 3 Huntao Dan，April Kelly，Ora Bernard，et al.Cytoskeletal Changes Regulated by the PAK4 Serine/Threonine Kinase Are Mediated by LIM Kinase 1 and Cofilin. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，2001，276(34)：32115-32121. 4 Claire M.Wells，Arie Abo and Anne J.Ridley.PAK4 is activated via P13K in HGF-stimulated epithelial cells.Journal of Cell Science，2002，115：3947-3956. 5 Yunbiao Lu，Zhong-Zong Pan，Yvan Devaux，et al.p21-activated Protein Kinase 4(PAK4)Interacts with the Keratinocyte Growth Factor Receptor and Participates in Oxidant-induced Cell Death. The Journal of Biological Chemistry，2003，278(12)：10374-10380. 6 Hongquan Zhang，Zhilun Li，Eva-Karin Viklund，et al.p21-activated kinase 4 interaces with integrinαvβ5 and regulatesαvβ5–mediated cell migration. The Journal of Cell Biology，2002，158(7)：1287-1297. 7 Nerina Gnesutta，Jian Qu，Audrey Minden.The Serine/Threonine Kinase PAK4 Prevents Caspase Activation and Protects Cells from Apoptosis. The Journal Biological Chemistry，2001，276(7)：14414-14419. 8 Shubha Bagrodia and Richard A.Cerione.PAK to the future. CELL BIOLOGY. Vol.9，Sep 1999. 9 R.Hugh Daniels and Gary M.Bokoch.P21-Activated protein kinase：a crucial component of morphological signaling? Elsevier Science Ltd.0968-0004/99/$-See front matter 1999. 10 Chuntao Dan，Niharika Nath，Muriel Liberto，et al.PAK5，a New Brain-Specific Kinase，Promotes Neurite Outgrowth in NIE-115 Cells. Molecular And Cellular Biology，2002，567-577. 11 Yick-Pang Ching，Veronica Y.L.Leong，Chi-Ming Wong，et.al.Identification of an Autoinhibitory Domian of p21-activated Protein Kinase 5. The Journal of Biological Chemstry，2003，278(36)：33621-33624. 12 Anja Knietsch，Susanne Bowien，Gregg Whited，et.al.Identification and Characterization of Coenzyme B12Dependent Glycerol Dehydratase-and Diol Dehydratease-Encoding Genes from Meta genomic DNA Libraries Derived from Enrichment Cultures.Applied and Environmental Microbiology，2003，3048-3060. 13 Melissa A.Eecgert， Jennifer M. Holder，William T.Gerthoffer.p21-activated kinase 1 participates in tracheal amooth muscle cell migration by signaling to p38 MARK.Cell and Molecular Biology Program and Department of Pharmacology， School of Medicine，University of Nevada，Reno，Nevada 89557-0046.Am J Physiol，2001，281：C123-C132. 14 方福德.真核基因表达调控（修订版），北京：高等教育出版社、施普林格出版社，
