葛根芩连片的含量测定研究进展(二)

（一）紫外分光光度法测定总黄酮的含量

紫外-可见分光光度法是在190~800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。从吸收光谱中，可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin。物质的吸收光谱具有与其结构相关的特征性。用于定量时，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。

卢兰芳老师分别对葛根芩连片含量测定实验的精密度、重复性、稳定性、准确度进行了考察，发现不论用HPLC测定葛根素含量还是用UV法测定总黄酮含量，都可以得到结果：RSD皆小于2%，符合规定，样品在12h内稳定。然而从实验数据可知，虽然葛根素的变化幅度较大(RSD为2.93%)，但是葛根总黄酮的含量更为稳定(RSD为1.21%)，因此她认为葛根芩连片的质量控制用后者作为指标更为合理。

夏延任、杨新春对葛根芩连片中4种样品均采用药材阳、阴对照液与样品供试液用同一方法、在同一薄层条件下进行对照试验，而且分别增加其主要有效成分葛根素、黄芩甙、盐酸小檗碱、甘草酸标准品进行对照。结果表明，各检出成分不受其它药物干扰，专属性强。实验中各批号样品总黄酮含量不同，在3.77%--5.75% 之间，平均值为4.61%，回收率平均为96.95%。

（二）毛细管电泳法

毛细管电泳法由于具有快速、高效、分辨率高、样品和试剂消耗量少以及毛细管柱寿命长等优点, 近年来备受关注。毛细管胶束电动色谱法 (MEKC) 是毛细管电泳法和色谱法相结合的一种分析技术, 既可以分析电中性化合物又可以改善带电物质的分离。李新民等通过优化缓冲溶液pH值和浓度、SDS浓度和β-CD浓度等条件,建立了一种毛细管胶束电动色谱法测定葛根素和大豆甙元的方法。在优化的条件下,两种物质在5min内得到良好分离。葛根素和大豆甙元的峰高和质量浓度分别在0.02-1.20mg/mL和0.02-1.00mg/mL浓度范围内呈良好线性。2种物质基于迁移时间和峰高的相对标准偏差分别为0.43%、0.22%和2.00%、1.39%。检出限分别为0.005mg/mL和0.004mg/mL。

（三）间接竞争酶联免疫分析(ELISA)法

刘姝晨等人利用黄芩苷单克隆抗体，通过考察线性关系、精密度、加样回收率等方法学指标，建立黄芩苷的间接竞争 ELISA 法，并用所建立的方法测定7个不同厂家葛根芩连片中黄芩苷的含量。试验中研究人员对黄芩苷间接竞争 ELISA 法进行了系列的方法学考察，结果表明以 CBS 缓冲液作为包被缓冲液，包被方式为37℃10 min＋4℃12 h，样品pH值调制于 7．4 左右，离子强度为0．01 M 缓冲体系，竞争反应时间1 h，显色时间15 min 条件下的灵敏度最佳。由此实验可得建立的黄芩苷间接竞争 ELISA 法的线性范围为16.157-1280mg/L，板间精密度RSD≤9．0%，板内精密度RSD≤5．1%，平均回收率为107．1% ( RSD=4．9%)。

含量测定结果显示，7个厂家生产的葛根芩连片中黄芩苷含量从4．45 mg/片到 13．41 mg /片不等，差距较大，所得结果与相关 HPLC 检测结果相符。

（四）HPLC法测定各主要成分的含量

HPLC法是中药制剂质量评价中较常用的分析方法，结合使用不同类型的检测器，如紫外测器（UV）、二极管阵列检测器（PAD）、荧光检测器（FD）、示差检测器、散射光蒸发检测器（ELSD）、质谱检测器（MS），可对各类成分作很好的分析研究。在2005年版《中国药典》，HPLC 法大量使用。2010  版《中国药典》一部中运用梯度洗脱的HPLC法明显增多。高效液相色谱法有“三高一广一快”的特点：高压；高效；高灵敏度；应用范围广；分析速度快、载液流速快。此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但有时也受到限制，如“柱外效应”，分析时间长，指标性成分易受杂质干扰、结果不好，柱易污染、难清洗等。

李丽莉等的实验条件是用反相高效液相色谱柱，以乙腈-0.02 mol/L醋酸铵+0.03%三乙胺溶液（用冰醋酸调pH为4.3）为流动相梯度洗脱，流速1.0mL/min,葛根素、大豆苷、甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、大豆苷元、甘草酸铵、黄芩素8个成分检测波长250 nm，汉黄芩素检测波长280 nm，表小檗碱、盐酸药根碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱5个成分检测波长346nm。结果：葛根素、大豆苷、甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、表小檗碱、盐酸药根碱、黄连碱、大豆苷元、盐酸巴马汀、甘草酸铵、盐酸小檗碱、黄芩素、汉黄芩素进样量分别在146.26-5850.24、24.13-965.04、18.45-738.00、79.18-3167.32、9.57-382.80、4.76-190.40、2.57-102.80、13.41-536.40、10.60-424.00、11.33-453.22、12.08-483.20、46.73-1869.25、20.28-811.20、12.11-484.50 ng 范围内与峰面积呈良好线性关系（R>0.9990）；平均加样回收率（n=6）分别为2.18%、1.79%、1.81%、1.68%、2.27%、2.13%、1.96%、1.07%、0.93%、0.61%、2.92%、0.77%、2.79%、0.62%；精密度、重复性、稳定性良好，RSD均小于3%。试验中各厂家样品各指标性成分均存在一定差异，进一步说明了开展中成药整体控制，多种成分同时测定比用单一指标成分控制中成药质量更可靠。

赵敏采用高效液相色谱法,Kromasil C18柱,流动相为甲醇-0.4%磷酸水(53:47),流速为1mL/min,检测波长为278nm。结果黄芩苷在0.4μg-2μg范围内呈良好的线性关系, R=0.9997,平均回收率为97.65%, RSD为2.45%(n=5) 。

    贾玉梅 包丽昕采用高效液相色谱法,色谱柱为Phenomenex C18柱,流动相为甲醇-0.1mol/L磷酸二氢钾溶液(45:55),检测波长为264nm。结果:盐酸小檗碱在10.05mg/l-40.20mg/l质量浓度内、黄芩苷在25.20mg/l-100.80mg/l内呈良好的线性关系。两者的平均回收率分别为100.1%和100.5%。

三、结论

本文对葛根芩连片含量测定方法讨论时发现目前对葛根芩连制剂的整体质量控制的研究多集中在葛根芩连汤上，且多为 HPLC法。针对葛根芩连片的含量测定主要针对葛根素、黄芩苷和盐酸小檗碱等单独的含量测定，而通过对制剂组方成分分析可知葛根素、黄芩苷等均为黄酮类化合物，可找到的文献中对总黄酮含量的测定方法实验较少。无论是单独对葛根素等成分测定还是对多种成分同时含量测定出现频率更高的也是HPLC法。近些年来更新兴的技术例如毛细管电泳法和ELISA法在含量测定中也由于方便快速准确的优点流行起来。

参考文献

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