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含黄芪制剂中皂苷类化合物的HPLC测定方法概述 (7)(二)
降低写糖血脂等作用:三七总皂苷在消化道内同脂类结合形成不易吸收的物质,防止脂质在血管内沉积从而保护内膜,减少损伤,防止动脉硬化,降低血脂水平,特别是三酸甘油酯含量明显降低。三七总皂苷对血糖的影响取决于动物的状态和机体血糖水平,可升高或降低血糖水平,具有自动双向调节血糖的作用。三七总皂苷能扩张血管产生降压作用、目前普遍认为作用机制为三七总皂苷是一钙道阻滞留,具有阻断甲肾上腺素所导致的ca内流作用表明三七总皂苷降血脂的同时能调节血压、双向调节血糖。同时服用三七粉也起到降血压、降血脂、双向调节血糖的作用。
二、黄芪概述 (一)黄芪的化学成分 经过大量的研究实验证明,中药学中所使用的黄芪具有化学成分较为复杂和多样,包含类多种糖类、黄酮类、皂苷类、氨基酸和微量元素。这些化学成分在煎煮过程中可能会发生变化,从而改变其原有的化学性质。具体来讲,黄芪的化学成分可以具体分为以下几类: 多糖类:主要有葡聚糖和杂多糖。其中葡聚糖又有水溶性葡聚糖和不水溶性葡聚糖,分别是a-(1-4)(1-6)葡聚糖和a-(1-4)葡聚糖。黄芪中所含的杂多糖多位水溶性酸性杂多糖,主要由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖组成,少量含有糖醛类由半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成;而有些杂多糖仅由葡萄糖和阿拉伯糖组成。 皂苷类:目前已从黄芪及其同属近缘植物中分离四十多种三萜皂苷类化合物,主要有黄芪皂苷、乙酰基黄芪皂苷、异黄芪皂苷、大豆皂苷等四大类。其中,黄芪甲苷是一种羊毛酯醇形的死缓三萜皂苷,是黄芪的主要有效成分,为黄芪基药材的定性定量指标。 黄酮类:多大四十余种,其中包括黄酮五种,异黄酮十二种、异黄烷十二种和紫檀烷四种、二氢异黄酮、紫檀烯等六大类,主要有榭皮素、三耐黄素、异鼠李素、鼠李异柠檬素、轻基异黄酮、异黄烷、芦丁、芒柄花素、毛蕊异黄酮等。 氨基酸:共二十五种,如Y-氨基丁酸、天冬氨酸、天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、肤氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等。 其他微量元素:除了上述化学成分,黄芪还含有多种微量元素、甾醇类化合物、叶酸、亚麻酸、亚油酸、甜菜碱、胆碱、咖啡酸、香豆素、尼克酸、核黄素、维生素P和多种无机元素。 (二)黄芪的药理作用在中医临床学中,黄芪因为具有复杂多样的化学成分和广泛的药用范围,而在多种疾病的临床治疗中有着广泛应用。目前很多医药学者和相关专家都对黄芪的药理作用进行了研究。笔者在综合了多个研究文献之后,将黄芪的药理作用研究进展综述为下述几种: 免疫调节:临床试验发现,黄芪中的总黄酮具有增加抗体形成、提高单核巨噬细胞吞噬功能的效果,说明黄芪的总黄酮具有特异性体液免疫作用的增强作用。
抗心肌缺血:临床试验发现,黄芪中的总黄酮可以显著减轻心肌缺血患者的血流动力学,增加心室肌细胞的幅值,增加心肌收缩力。影响血管内皮细胞:临床试验发现,黄芪中的总黄酮可以改善内皮细胞的通透性,抑制因为低渗所造成的液体滤过流量。防治肝损伤:临床试验发现,黄芪可以有效抑制因为缺血导致的AST、ALT的升高,改善肝损伤,可以有效降低因为毒性代谢而造成的肝损伤。抗炎:黄芪可以降低滑膜细胞和血清脂质过氧化物的一氧化氮,进而发挥一定的抗炎作用。 抗突变:黄芪可以有效抑制动物细胞的基因突变,可明显抑制环磷酰胺诱发细胞微核出现基因突变,可避免因为放化疗导致的细胞损伤,保护超氧化物歧化酶活性。 消除自由基:黄芪具有较强的消除自由基作用,并且清除能力比较理想。抗骨质疏松:黄芪可以显著提高骨质疏松患者的骨密度,显著提高抗外力作用,研究认为和黄芪拟雌激素样作用有密切关系。抗氧化:经过临床实践发现,利用黄芪进行抗氧化、抗衰老试验能够取得很好的效果。这是因为黄芪所含有的多糖能够极大的提升血超氧化物SOD、CAT、谷胱甘肽以及GSH-PX等酶的活性从而使血浆、脑匀浆与肝匀浆里的LPO含量大大减少,从而达到了良好的抗氧化效果。
抗辐射:有学者发现黄芪能够促进淋巴细胞的转化,能够清除人因为遭受辐射而产生的自由基,从而提高了人对辐射的抵抗能力,这一发现表面黄芪能够起到抗辐射的效果,这对于当前普遍受到各种辐射影响的人们来讲,无疑是一个“福音”。抗肿瘤:黄芪能够抑制低淋巴转移(HepA)小鼠肿瘤生长,增加免疫器官重量,促进体内IL-2的产生,提高小鼠单核吞噬细胞功能,说明黄芪作为生物诱导剂能够增强荷瘤小鼠的免疫功能,从而起到抗肿瘤作用。通过体外抑瘤实验证明:黄芪总提取物(TAE)20~160mg?L-1对人肝癌(Be-7404)细胞和人宫颈肿瘤(HeLa)细胞有明显的抑制作用,提示TAE不仅在整体水平有抑瘤作用,而且对癌细胞有直接的抑制作用。
总之,黄芪是一种具有非常大药用价值的中药药材,在探讨中我们发现,目前临床对于黄芪的药理活性和临床应用上研究的主要对象是黄芪的总黄酮类化学成分。尽管目前我们已经研究出黄芪的多种化学成分和药理作用,但是对于黄芪的药用价值来讲,这些研究还是处于起到阶段。相信在以后的医药学发展中,通过中药药理学研究的不断深入,各种检测手段的不断发展,黄芪的化学成分、药理活性、临床应用研究会越来越深入,会为人类的健康作出更大的贡献。
三、含黄芪制剂中皂苷类化合物的HPLC测定方法 (一)HPLC测定皂苷类化合物方法简介 三萜皂苷的HPLC测定方法有高效液相色谱-紫外检测器法 、高效液相色谱法-二极管阵列检测器法。 高效液相色谱法 近年来,随着高效液相色谱仪的普及,越来越多的皂苷成分开始使用到了这项技术。由于它 能有效处理非挥发性和极性较强的化合物,可以较好分离出主成分峰和杂质峰,能反映样品的真实含量,方法简便、准确、灵敏有利于产品质量的控制,从而使它成为了测定皂苷的一种最有效最常用的方法,但HPLC 仪器昂贵,而且要求有对照品。 高效液相色谱-紫外检测器法 该方法是HPLC 中测定有紫外吸收的皂苷常用方法,广泛应用于三萜皂苷如人参皂苷、女贞子中齐墩果酸含量的测定中。紫外检测器由于对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感,所以还能用于梯度淋洗,但它非通用检测器, 它要求被测物质有较强的紫外吸收或本身无紫外吸收但转化后有吸收紫外线的基团。 高效液相色谱-二极管阵列检测器法 二极管阵列检测器(diode-array detector,DAD)是先让所有波长的光都通过流动池, 然后通过一系列分光技术,使所有波长的光在接受器上被检测。和普通的紫外—可见分光检测器相比, 二极管阵列检测器进入流动池的光不再是单色光。它具有以下优点:⑴可极为方便地得任意波长的色谱图;⑵可得任意时间的光谱图,相当于与紫外联用;⑶提供组分的定性信息。也就是说,二极管阵列 检测器不仅可用于定量检测,还具有辅助定性、峰纯度评估等功能,可得到立体的光谱-色谱图,对有特征紫外吸收的化合物的定性很有帮助。 甾体皂苷的HPLC测定方法主要有高效液相色谱-示差折光检测器法、高效液相色谱-蒸发光散射检测器法。 高效液相色谱-示差折光检测器法
示差折光检测器(differential refractometers detector,RID)是除紫外检测器之外应用最多的检测器。其优点是通用性强,操作简便;缺点是灵敏度低,最小检测浓度达10-6 ~10-7g/mL,不能做痕量分析,线性范围宽小于105,对压力和温度变化敏感,此外,由于洗脱液组成的变化会使折射率变化很大,因此,这种检测器也不适用于梯度洗脱。由于甾体皂苷元无紫外吸收或紫外吸收较弱且主要 存在于低波区,给HPLC 定量检测带来了一定的困难。而示差折光检测器属于总体性能检测器, 是根据不同物质具有不同折射率来进行组分检测的, 凡是具有与流动相折射率不同的组分,均可以使用这种检测器,因此是一种通用型检测器,它对没有紫外吸收的物质,如高分子化合物,糖类,某些皂苷等都能检测。 高效液相色谱-蒸发光散射检测器法
和三萜皂苷的测定相比,高效液相色谱-蒸发光散射检测器法更多地应用在了甾体皂苷的测定中。方法简便,重复性好,结果稳定,能取得了较好的结果。 (二)含黄芪制剂中皂苷类化合物的HPLC测定实例 实验人 山西医科大学 王鹏 方法 高效液相色谱法 结论 采用70%乙醇回流提取,水饱和正丁醇萃取,D101大孔吸附树脂富集纯化黄芪总皂苷,硅胶柱层析分离不同的皂苷组分;采用薄层色谱法(TLC)、高效液相-示差检测器法(HPLC-RID)进行皂苷类成分的鉴定和含量测定。结果:从黄芪总皂苷中分离出六种黄芪皂苷化合物(AS-Ⅰ~AS-Ⅵ),其中AS-Ⅰ部分经鉴定主要含皂苷Ⅱ,质量分数为29.4%,AS-Ⅲ部分经鉴定主要含皂苷Ⅳ,质量分数为22.82%。其余4个部分有待于进一步鉴定。结论:此法能较好的分离和纯化黄芪皂苷,TLC和HPLC-RID法操作简便,可作为黄芪皂苷的鉴定和含量测定方法。 实验人 中国科学院兰州化学物理研究所甘肃天然药物重点实验室 (陈娟 师彦平) 方法 高效液相色谱法 结论 本实验考察了黄芪水提取液醇沉除多糖和蛋白质,乙醚除脂类物质,过Al2O3∶MgO滤层除黄酮,最后制得甲醇浸液的工艺,结果表明,此方法提取完全,损失少,分离度良好。b.鉴于黄芪皂苷种类较多,结构相近,紫外扫描只在200nm有末端吸收,原田正敏因此定在200nm处检测〔4〕.我们实验表明,波长越长,噪音越小,但灵敏度越低;越靠近200nm,灵敏度越高,但噪音越大.综合考察这两个因素,本实验选择205nm为测定波长。 c.黄芪中甲苷的含量很低,而且受产地、生长时间、采收季节等因素影响,具体差异有待于进一步研究。 实验人 新安县中医院 张骞 方法 高效液相色谱法 结论 在研究过程中皂苷的提取比较顺利,其方法的选择性比较方便和快捷,不同比例的展开剂三氯甲烷-甲醇-水的比例不同(13:7:2.12:8:2),而三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-水的比例也不相同(13:7:2:2.12:8:2:2.11:9:2:2.6:3:1:1等),将乙酸乙酯添加到展开剂中,可以让斑点显示更加清晰,让背景颜色变的更浅,有效的减少其他成分对结果的干扰,而在皂苷含量当中,AS-I和AS-III的含量占皂苷的主要组成部分。在研究中采用示差检测器检测,取得了较好的结果。本组研究中使用的方法可以有效的对黄芪中的黄芪皂苷进行提取和含量测定,帮助其判定皂苷的含量检测,同时也是一种比较便捷的一种方法,在临床试验中可以进行借鉴使用。 实验人 中国药科大学中药分析教研室 汪红 王强 方法 高效液相色谱法 制剂 黄芪注射液 结论 ELSD是一种通用型质量检测器,尤其适用于没有紫外吸收的皂苷类化合物。本实验采用HPLC-ELSD法对黄芪注射液中3种皂苷含量进行测定,结果证明,在上述色谱条件下皂苷IV,III,I能达到良好分离,结果可靠,重现性好,适用于黄芪及其制剂的质量评价标准。我国药典采用薄层扫描法对甲苷进行测定,前处理以氨试液洗涤,含量远高于未用氨试液处理者。有文献3报道,黄芪中5种黄芪皂苷以黄芪皂苷IV为基本母核,其糖链上有1-3个乙酰基,用碱处理时,乙酰基易脱落成为黄芪皂苷IV。本实验对氨试液处理与未经氨试液处理时的黄芪图谱与含量进行比较,表明后者黄芪皂苷的种类多余前者,由于缺少对照品,有2个主要皂苷未能定量,不能说前者皂苷含量与后者皂苷IV具等量关系,但验证类文献说法。黄芪中有效成分为总皂苷,将其转化为单一成分进行定量,既能对药材的综合品质进行评价,又能快速、简单操作,因此是可行的。 参考文献
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