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医药医学类
葛根芩连片的含量测定研究进展(二)
(三)紫外分光光度法
紫外可见分光光度是利用物质分子对紫外可见光谱区的辐射的吸收的一种原理,广泛用于无机和有机物质的定性和定量分析。在国际上发表的有关分析的论文中,光度法约占28%。由于各种各样的无机物和有机物在紫外一可见区域都有吸收,因此均可借此方法加以测定。另外紫外可见分光光度计价格相对低廉,分析成本低,在使用过程中仪器几乎没有什么耗损。优点是操作简便、快速;准确度高:对于一般的分光光度法来说,浓度测量的相对误差在l%-3%范围内,如采用示差分光光度法测量,则误差往往可减少到千分之几。
(四)毛细管电泳法
CE与HPLC相似都是高效分离技术, 操作可自动化, 且有多种不同分离模式。但是CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间, 分析时间通常不超过30min, 比HPLC速度快;其他分离存在两相,电泳是均相。对CE而言,理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比, 对扩散系数小的生物大分子而言, 其柱效高。CE所需样品为nl级, 最低可达270 fl, 流动相用量也只需几毫升。然而CE仅能实现微量制备。
(五)酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法是指利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点,将游离的杂蛋白和结合于固相载体的目的蛋白分离,并利用特殊的标记物对其定性或定量分析的一种检测方法。其原理是抗原或抗体能物理性地吸附于固相表面,并且保持其免疫活性;抗原或抗体能与酶通过共价键形成酶结合物,同时保持各自的免疫活性或酶活性;酶结合物与相应的抗原或抗体结合后,能通过加入底物的颜色反应来确定免疫反应的发生,颜色反应的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比。
(六)超高效液相色谱法
超高效液相色谱(UPLC)是分离科学中的一个全新类别,UPLC借助于HPLC的理论及原理,涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术,增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。超高效液相色谱法的原理与高效液相色谱法基本相同,所改变的地方有以下几点:小颗粒、高性能微粒固定相的出现;超高压输液泵的使用;高速采样速度的灵敏检测器;使用低扩散、低交叉污染自动进样器;仪器整体系统优化设计。色谱工作站配备了多种软件平台,实现超高效液相分析方法与高效液相分析方法的自动转换。与传统的HPLC相比,UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍,它缩短了分析时间,同时减少了溶剂用量降低了分析成本。
四、葛根芩连片中葛根素的含量测定实例
(一)高效液相色谱法
谭生建等人采用RP-HPLC法测定葛根芩连片中葛根素含量。采用Shim-Pack CLC-ODS(15mm×6mmID)分析柱;北分厂ODS保护柱;流动相:甲醉-水(23:77);流速:1.0ml/min;色谱柱温度:35℃;检测波长:250nm;进样体积10μl;外标法计算含量。理论板数按葛根素峰计算不低于2000;葛根素浓度在 范围与色谱峰面积呈线性关系;R=0.9999;回收率及RSD分别是97.6%、1.8%。张启云,徐良辉等人采用反相高效液相色谱法测定,色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse SB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相: 甲酸铵( p H 3.0、10 mmol/L-1) -乙腈,梯度洗脱;流速:1 m L/min-1; 检测波长: 270、360 nm;柱温:25℃;进样量:20μL。结果:葛根素质量浓度在1.12-22.3μg/mL-1(r=0.9990) 范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系。平均回收率( n=5)在95%-105%范围内,RSD小于3.0%。
李向阳,李振国选用HPLC对含量测定的色谱条件、测定范围、样品测定条件等进行了验证。实验使用仪器为岛津LC-10Avp高效液相色谱仪,SPDM-10Avp二极管阵列检测器,CLass-vp5.0色谱工作站;试剂及药品为葛根芩连片,由天津药业集团新郑股份有限公司提供,批号分别是041208, 041210,041212;葛根素对照品,购自中国药品生物制品检定所(含量测定用,批号为753-20007);甲醇为色谱纯;水为重蒸水;其他试剂为分析纯;采用HypersilC18柱(4.6mm×250mm,5μm),柱温40℃;进样量5μL,甲醇-乙腈-水(6:9:85)为流动相,流速1.0mL/min,检测波长为250 nm,理论板数按葛根素计算不低于2000,按此色谱条件测定,葛根素的保留时间为11.8min。葛根素在0.0776-0.7760μg呈良好的线性范围(r=0.99997);平均回收率为101.02%,RSD为2.91%。
(二)薄层扫描法
秦文清建立TLCS法测定葛根芩连片中葛根素含量。他使用了岛津CS- 9000薄层扫描仪,紫外线分析仪;薄层定量毛细管;硅胶GF254定量预制板。试剂为葛根素、芦丁对照品,葛根芩连片(市售品,批号951116,980810,981013)。实验用乙酸乙酯:甲酸:水(8:1:1)为展开剂,采用单波长反射锯齿扫描,入=275nm,Sx= 3。结果:线性范围在0.38-3.8ug,r=0.9993平均回收率为96.87%。宋金荣等人选用薄层扫描法,使用仪器为Cs-910双波长薄层扫描仪、DR-2色谱处理机;试剂为葛根素对照品 ( 中国药品生物制品检定所批号,:752-200108),葛根芩连片(江西余江制药厂,批号:020321、020417、020622,市售品)其他试剂均为分析纯;固定相为硅胶;流动相:氯仿-甲醇-乙酸乙酯-水(14:6:3:1);参比波长370nm;测定波长254nm;结果:葛根素在0.5-2.5μg范围内呈良好的线性关系 (r=0.9992),平均回收率97.99%,RSD为2.10%。
(三)其他
1.分光光度法
梁文法等点样于硅胶G板上,用氯仿-无水乙醇( 7:3)为展开剂,在紫外灯365nm 下定位葛根素,刮下斑点。以乙醇作空白,在251nm处测定吸光度,标准曲线法计算葛根中葛根素含量,线性范围为1-5μg/mL,平均回收率为98.6%。
2.酶联免疫吸附测定法
单文超等建立间接竞争酶联免疫分析法测定葛根中葛根素的含量,线性范围为 15.6-500ng/m L,孔间差和板间差均不大于3.5%,平均回收率为101.8%,并且该法检测结果与HPLC 法检测结果一致。
五、总结
葛根芩连片中的葛根素的测定方法很多,各具特点。高效液相色谱法是测定葛根素含量的常用方法,具有重复性好、结果准确的优点,但耗时、成本较高。液质联用技术是一种分离分析复杂有机混合物的有效手段,灵敏度高、选择性好,但仪器较昂贵,其应用还不够普遍。超高效液相色谱法与传统的 HPLC 相比,增加了分析的通量和灵敏度,能快速分离样品,同时节省流动相,降低分析成本。近红外光谱法具有分析速度快、对样品无破坏性、无污染、操作简便、结果精准等优点,可实现葛根素的快速分析和在线检测。酶联免疫吸附测定法具有特异性强,灵敏度高,仪器化程度低,经济无污染等特点,特别适用于分析微量基质生物样品中葛根素含量。随着含葛根素药物的指纹图谱和质量标准研究的不断发展,通过多种分析方法的联用,能寻求到简便快速、准确高效的测定方法,为葛根芩连片的含量测定提供更可靠的依据。
参考文献
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3.曹志红.薄层层板-紫外分光光度法测定葛根芩连片中葛根素的含量[J].云南中医杂志,1993,14(5):30
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